Diagnóstico de herpesvírus bovino (BoHV-1 e BoHV-5) em sêmen

Resumo

Os herpesvirus bovinos pertencem à família Herpesviridae, tendo como característica principal o estabelecimento de latência com posterior reativação viral causada por fatores como estresse e uso de corticoide. Devido a essa capacidade, os animais infectados eliminam vírus de maneira intermitente em excreções e secreções corpóreas, necessitando-se de ferramentas diagnósticas sensíveis e específicas para os programas de controle. Os herpesvirus bovinos apresentam distribuição mundial, tendo grande importância econômica para a pecuária brasileira, destacando-se o Herpesvirus Bovino 1 (BoHV-1), causador da rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR) e balanopostite e vulvovaginite pustular infecciosa (IPB/IPV),e o Herpesvirus bovino 5 (BoHV-5), que cocircula nos rebanhos juntamente com o BoHV-1, induzindo quadros de encefalite, além de quadros respiratórios e reprodutivos. Devido à importância crescente da inseminação artificial no Brasil, e sendo o sêmen uma via de transmissão importante, este trabalho tem como objetivo a elaboração de um teste diagnóstico molecular rápido e específico para a detecção do BoHV-1 e BoHV-5 em sêmen bovino. Amostras virais padrão foram cultivadas em células CRIB e o DNA total foi extraído com Tri-reagente segundo instruções do fabricante. Padronizou-se uma PCR utilizando iniciadores para a amplificação do gene viral codificador da glicoproteína G (495pb para BoHV-1.1, 1.2 e 531pb para BoHV-5) e do gene normalizador GAPDH (97pb). Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose e observaram-se amplicons nos tamanhos moleculares esperados para cada gene. Foi produzido um plasmídeo contendo os genes viral e normalizador e os insertos foram conferidos por sequenciamento gênico. A PCR foi então repadronizada como duplex (gG + GAPDH) com sucesso, variando-se condições de extringência e de concentração dos iniciadores para os dois distintos genes. O teste mostrou alta sensibilidade (detecção de 400 fentogramas de inserto) e a especificidade foi avaliada com outros herpesvírus animais e humanos pertencentes à mesma família, tendo amplificado somente BoHV-1 e BoHV-5. A PCR duplex desenvolvida foi utilizada com sucesso em amostras clínicas de sêmen bovino provenientes de um rebanho de animais soropositivos para BoHV-1 e BoHV-5, evidenciando o seu uso para triagem de sêmen.