Diagnóstico do vírus da diarreia viral bovina (BVDV) em amostras de sêmen por rt-pcr convencional e cinética

Resumo

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um importante patógeno que infecta rebanhos bovinos do mundo inteiro, pertencente à família Flaviviridae e ao gênero Pestivirus. A infecção por BVDV pode causar problemas gastrointestinais, respiratórios e reprodutivos, com con-sequente prejuízo para a pecuária nacional. Nesse contexto, destaca-se a infecção uterina gerando animais persistentemente infectados (PI), responsáveis pela manutenção do vírus nos rebanhos. Circulam nos rebanhos dois genótipos do BVDV (BVDV-1 e BVDV- 2), pertencentes a dois biótipos (amostras citopatogênicas – CP – ou não citopatogênicas – NCP), dependendo do efeito em cultura celular, com diferentes graus de virulência. O sêmen de animais infectados se destaca como forma de transmissão viral na inseminação artificial (IA), monta natural ou pela transferência de embrião, sendo preconizada pela OIE a testagem do sêmen. O objetivo deste trabalho foi a padronização de um teste de PCR sensível e específico para o diagnóstico do BVDV em sêmen bovino. O BVDV-1 (ATCC NADL), expandido em células MDBK (CCL-22, ATCC) e cultivadas com 10% de soro fetal equino, foi utilizado para a extração do RNA total com Tri-reagente segundo as instruções do fabricante. Inicialmente, produziu-se cDNA utilizando o kit Improm II (Promega®), seguido de reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando-se iniciadores específicos que ancoram na região 5’UTR (290 pb), região conservada dos Pestivirus. O amplicon foi clonado em vetor plasmidial pGEM-T-easy seguido de sequenciamento para a confirmação da especificidade do teste. A sensibilidade do teste foi aferida com o plasmídeo diluído na base 10, tendo sido a detecção observada até 44 fentogramas. Em seguida, o teste foi repadronizado em passo único (RT-PCR) para aumentar a sua rapidez e eficiência, utilizando-se um kit. Foram testadas 12 amostras clínicas de sêmen bovino provenientes de um único rebanho, tendo apresentado 83,3% de positividade (10/12). O passo seguinte foi a padronização da PCR para o sistema cinético (PCR em tempo real). O plasmídeo produzido foi então linearizado com enzima de restrição Sal I e purificado do gel. A PCR foi padronizada com o uso do corante Syber Green, e os resultados mostraram um slope -3,341 e eficiência de 99,194%. Tanto o teste de PCR convencional quanto o de PCR cinética desenvolvidos mostraram-se eficientes para o diagnóstico do BVDV em sêmen, destacando-se o seu uso em programas de controle.